在核酸檢測過程中,核酸提取磁珠因檢測靈敏度高、操作可自動化、高通量、安全和快速等特性,被廣泛應用。但在核酸提取過程中,需要注意的細節較多,一處出錯都會導致結果的失敗,下文幫大家整理出了一些常見問題并進行解答,希望對你會有幫助。
1、增加磁珠的用量,可以改善核酸提取效率嗎?
在提取效果不佳的時候,有人會認為增加磁珠的用量,就能吸上更多的核酸,提高核酸提取量,但其實這種方法很難達到目的。
磁珠用量過多,會導致其無法均勻分散到各步溶液體系中,降低其分散性,導致吸附、洗滌和洗脫過程的不全。過量的磁珠也會吸附更多的雜質,磁珠表面沒有結合核酸的位點,會給雜質的結合提供更多機會。一般情況下,磁珠法核酸提取試劑盒中給出的磁珠用量都足夠滿足大家常見的應用場景,如果遇到核酸提取收率低的問題,需要對裂解結合、清洗和洗脫過程等方面充分考慮。
2、如何避免核酸提取過程中核酸降解?
每個步驟都要注意充分的混合均勻,避免團塊的殘留影響實驗結果;在洗脫時,時間過長或者溫度過高,核酸有可能會降解;樣本切記不可反復凍融,提取的樣本要注意在合適的溫度保存,長期保存盡量 -80 ℃。
3、樣品裂解效果不好,能否通過增加裂解液使用量,改善裂解效果并提升提取效果?
對于磁珠法而言,每增加一部分液體體積,就減少了更多的磁珠碰撞幾率,而降低磁珠碰撞幾率,會導致吸附率的大幅度下降。所以很多時候,雖然增加裂解液和洗滌液確實能夠起到增強裂解和增強洗滌的作用,但磁珠法提取的核心是磁珠吸附核酸的效率,無法保證磁珠碰撞效率是不能保證核酸提取效率的,所以單純增加試劑使用量改善提取效果并不一定全有效。
4、核酸提取純度不高,有蛋白或鹽殘留,是否清洗次數越多越好?
核酸提取純度不高,可適當增加一到兩次清洗次數。如果清洗次數過多,會增加清洗過程中的核酸損失量。一般情況下,清洗次數在2-4次為宜。